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組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實驗等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用。對本文其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關(guān)操作步驟進行介紹。
冰凍切片
是免疫組織化學(xué)染色中的一種切片方法。其優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢。基于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。
(1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時間，減少冰晶的形成。其方法有二：
①干冰-丙酮(酒精)法：將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯(50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時即可使用。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。
②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時 即開始?xì)饣序v，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆茫蛑萌牒憷湎淝衅瑱C冰凍切片。
(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。
影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機有兩類：
①恒慢冰凍切片機(Cryastat)：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，*能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。
②開放式冰凍切片機：包括半導(dǎo)體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。
冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)， 或進行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存
石蠟切片
其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃。C下進行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋)。
以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。
石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。
石蠟切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。
振動切片
用振動切片機(Vibratotme)，可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20～100μm，以漂浮法在反應(yīng)板進行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位，修整組織進行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實用于免疫電鏡觀察。
塑料切片
塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類(Epon 812,618)，其優(yōu)點是可以同時作光鏡和電鏡檢測，能相互對照所查抗原，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時半薄切片進行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點狀，定位后進一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。
超薄切片
電鏡標(biāo)本制作，應(yīng)用超薄切片機(Ultrotome)進行切片。
碳蠟切片
碳蠟(Carbowax)，學(xué)名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。
本法的特點是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過程簡單易行。
具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內(nèi)，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液)，52℃ 30min。④浸入等量混合碳蠟液(或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應(yīng)盡量避免與水或冰接觸，貯存時應(yīng)密封干燥冷藏。
本法優(yōu)點是操作程序減少，時間縮短，組織不經(jīng)有機溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結(jié)構(gòu)清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難，連續(xù)切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強吸濕性，不易保存時間較長。
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